Su origen se remonta al martirio de los santos Justo y Pastor, acaecido en este lugar a comienzo del siglo IV. A partir del siglo V se suceden varias construcciones dedicadas a los Santos Niños. En 1122 se constituye como parroquia y en 1477 es reconstruida por el arzobispo Carrillo de Acuña, elevándola al título de Colegiata. A partir de 1497, el Cardenal Cisneros encarga la actual obra a los arquitectos Antón y Enrique Egas, edificándola en estilo gótico tardío siguiendo el modelo en planta de la Catedral de Toledo. A lo largo de su historia, el templo ha ido incorporando formas y estilos arquitectónicos y artísticos, como, por ejemplo, la esbelta y proporcionada torre, diseñada por Rodrigo Gil de Hontañón, el Claustro clasicista o la capilla de San Pedro, obra del siglo XVII.
En 1519, gracias a la voluntad del Cardenal Cisneros, el Papa León X la eleva al título de Magistral, que obligaba a que sus canónigos fueran a la vez maestros de la Universidad. A partir de este momento, sólo dos iglesias ostentan este título: la de Alcalá y la de San Pedro de Lovaina. El grado de Catedral lo consigue en 1991 al reinstaurarse la diócesis complutense.
Su interior rebosa historia y arte, todo ello unido al gran patrimonio conservado a lo largo de los siglos, que hoy se puede admirar en su Museo y Centro de Interpretación. Además, en el templo se conservan las reliquias de los Santos Justo y Pastor y las de San Diego de Alcalá y las sepulturas del Cardenal Cisneros y del Arzobispo Carrillo de Acuña.
El Museo de la Catedral-Magistral, situado en la zona de la antigua Sala Capitular, muestra una parte del rico patrimonio heredado por el principal templo de la ciudad. Pintura, orfebrería, pintura, escultura conforman un auténtico tesoro en piezas de gran valor artístico e histórico. El Centro de Interpretación completa de una manera didáctica al museo, desarrollando su contenido en el claustro barroco.
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